Экспериментальное исследование воздействия светокислородного и фотодинамического эффектов на воспалительную реакцию кожных покровов, вызванную гистамином

ВВЕДЕНИЕ

В научной литературе подробно изложены механизмы повреждения биообъектов за счет генерации синглетного кислорода при возбуждении различных пигментов-фотосенсибилизаторов в аэробных системах – так называемый фотодинамический эффект (ФДЭ) [1]. Гипотеза о возможности повреждения клеток и тканей за счет генерации синглетного кислорода без фотосенсибилизатора (ФС) при прямом фотовозбуждении растворенного в тканях кислорода была высказана российскими исследователями еще в конце 80-х годов прошлого века [2–5]. Эта гипотеза, названная светокислородным эффектом (СКЭ) [6], получила свое подтверждение, однако механизмы реализации СКЭ в биологических объектах до сих пор до конца не выяснены и в настоящее время широко обсуждаются [7]. Для его развития необходимо узкополосное (квазимонохроматическое) излучение в определенных спектральных интервалах, соответствующих полосам поглощения, растворенного в водной среде молекулярного кислорода. В водных системах наибольший выход синглетного кислорода наблюдается при действии света в инфракрасном диапазоне спектра при 1264–1270 нм. На модельных системах экспериментально доказано образование синглетной формы кислорода, растворенного в различных средах в соответствии с парциальным давлением, при прямом лазерном возбуждении в инфракрасной полосе его поглощения [8]. Установлено, что генерация синглетного кислорода в водных средах при СКЭ на 3–4 порядка меньше, чем при ФДЭ, при этом генерация синглетного кислорода в биологических объектах до сих пор напрямую не определена. Тем не менее многочисленные работы подтверждают, что облучение биологических объектов в области основных полос поглощения кислорода вызывает специфические эффекты [9].

За счет генерации синглетного кислорода ФДЭ (трехкомпонентный – фотосенсибилизатор, свет и кислород) и СКЭ (двухкомпонентный – свет и кислород) имеют определенную общность и различия [10]. В комплексе физико-химических и медико-биологических исследований, выполненных за последние два десятилетия, установлены некоторые механизмы биостимулирующего и фотодеструктивного действия ФДЭ и СКЭ. При этом известно, что ФДЭ в зависимости от применяемых методик может оказывать влияние на ряд биологически активных веществ эндогенного происхождения, а следовательно, на микроциркуляцию и протекание воспалительных процессов при его клиническом применении [11]. Однако воздействие ФДЭ и тем более СКЭ на химическую структуру низкомолекулярных био­логически активных веществ практически не изучено, хотя показано, что при СКЭ синглетный кислород может изменять структуру белковых молекул [12].

Высказано предположение, что образующийся в биологических объектах синглетный кислород может приводить к следующим процессам.

1. Аллильное замещение в олефинах.

2. [ 2 + 2] – циклоприсоединение к С = С связям с высокой π-электронной плотностью, при этом образуются 1,2-диоксиданы, затем продукты их превращения, например карбонильные соединения:

3. [ 4 + 2] – циклоприсоединение к сопряженным диенам (диеновый синтез):

В таком случае генерация синглетного кислорода будет приводить в первую очередь к повреждению клеточных и субклеточных мембран, изменению антигенных свойств органов и тканей, а также к перекисному окислению циклических соединений (пуриновых и пиримидиновых оснований, холестерина, стероидных и половых гормонов, желчных пигментов, порфиринов, гистамина) и алифатических соединений (ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, сфигномиелин, цереброзиды), причем степень деструктивного воздействия будет строго зависеть от концентрации синглетного кислорода и, следовательно, от дозы лазерного облучения [13][14].

Ранее нами были получены данные, косвенно свидетельствующие о возможности инактивации гистамина при ФДЭ in vitro и в экспериментах на животных in vivo при оценке скарификационных кожных проб [15].

Из представленных в списке биологически активных веществ, на химическую структуру которых синглетный кислород может оказывать воздействие, особый интерес представляет гистамин, который был нами выбран для модельных экспериментов на лабораторных животных и добровольцах с использованием низкоэнергетических лазерных аппаратов. Известно, что гистамин окисляется кислородом с образованием альдегида, аммиака и перекиси водорода. Альдегиды могут связываться с свободными аминогруппами, вызывать сшивки белков, дезактивируя их, а перекись водорода в зависимости от значения рН раствора может быть как окислителем, так и восстановителем. Как влияет на эти процессы переход эндогенного кислорода в синглетное состояние под влиянием ФДЭ и СКЭ, остается открытым.

Гистамин является одним из эндогенных факторов (медиаторов), участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда болезненных состояний.

Свободный гистамин обладает высокой активностью: он вызывает спазм гладких мышц (включая мышцы бронхов), расширение капилляров и понижение артериального давления; застой крови в капиллярах и увеличение проницаемости их стенок; вызывает отек окружающих тканей и сгущение крови. В связи с рефлекторным возбуждением мозгового вещества надпочечников выделяется адреналин, сужаются артериолы и учащаются сердечные сокращения [16].

В связи с вышеизложенным нами проведено исследование по воздействию ФДЭ и СКЭ на воспалительную реакцию кожи лабораторных животных и добровольцев, вызванную гистамином. Исследование проводилось с целью получения биологических моделей для оценки воздействия синглетного кислорода на биологические мишени.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовать сравнительное воздействие светокислородного и фотодинамического эффектов на развитие воспалительной реакции, вызванной гистамином, для изучения механизмов воздействия синглетного кислорода на биологические объекты и для оптимизации применения их в клинической практике.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведенное исследование состояло из трех этапов.

ПЕРВЫЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведен эксперимент по воздействию лазерного излучения с длиной волны ≈1265 нм на развитие гистаминовой папулы на коже крыс. Работа проводилась на 10 крысах самках популяции Wistar массой 250–300 г. У животных на спине выстригали участок кожи для нанесения скарификаций. После нанесения иглой скарификации на поверхность кожи из пипеточного дозатора наносили раствор гистамина 0,01 % (гистамина гидрохлорида фирмы Allergopharma, Германия) с концентрацией 5 мг/мл в объеме 20 мкл. Доза гистамина, наносимая на скарификацию, составляла 0,1 мг. Для получения контрольных данных проводили измерение линейкой толщины кожной складки. С интервалом 2 см от контрольных скарификаций наносили экспериментальные скарификации. Далее проводили последующее облучение этих мест отечественным диодным лазером «Супер Сэб» с λ ≈ 1265 нм с непрерывным режимом излучения (производство ООО «Новые хирургические технологии», г. Москва). Облучение проводилось с расстояния 3,5 см при мощности 0,5 Вт в течение 2 мин на площадь 2 см² (плотность мощности 0,25 Вт/см², экспозиционная доза облучения – 30 Дж/см²). Измерение толщины кожной складки у животных (что соответствует размерам гистаминовой папулы у людей) проводили с интервалом 10 мин. в течение 40 мин.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием сред Windows 10 и компьютерной программы Excel 2016.

ВТОРОЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение концентрации раствора гистамина in vitro после облучения лазером с длиной волны 1265 нм.

Проведено облучение гистамина в концентрации 100 нг/мл лазером с длиной волны 1265 нм в следующих экспозиционных дозах: 28,8 Дж/см² (0,08 Вт, 180 с); 60 Дж/см² (0,5 Вт, 60 с); 120 Дж/см² (0,5 Вт, 120 с); 420 Дж/см² (0,7 Вт, 300 с); 540 Дж/см² (0,9 Вт, 300 с); 720 Дж/см² (1,2 Вт, 300 с). Облучение раствора гистамина осуществлялось в пробирках типа эппендорф, в объеме 250 мкл, с экспозицией на площадь 0,5 см². Определение концентрации гистамина проводили посредством иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Histamine ELISA, фирмы IBL, Германия, и прибора Multiscan MS производства фирмы Labsystems, Финляндия, для определения оптической плотности раствора.

ТРЕТИЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

В этом этапе исследования принимали участие 12 здоровых добровольцев. Постановку скарификационных проб с использованием гистамина проводили на коже внутренней стороны предплечья. Для постановки кожных проб с гистамином использовали 0,01 % раствор гистамина. В качестве фотосенсибилизатора использовали 0,1 % гель «Фотодитазин» производства ООО «ВЕТА-ГРАНД», г. Москва, РУ № ФСР 2012/13043. Фотосенсибилизатор наносился за 50 минут до скарификации и перед началом эксперимента тщательно удалялся слабым спиртовым раствором. Облучение проводилось лазерным аппаратом «Аткус-2» (производства ЗАО «Полупроводниковые приборы, г. Санкт-Петербург) с λ ≈ 662 нм, плотностью мощности 0,3 Вт/см². Экспозиционная доза составляла 50 Дж/см². Внутреннюю сторону предплечья у каждого добровольца разделили на 4 участка: 1) контрольный участок – нанесение раствора гистамина (гистаминовая проба); 2) гистаминовая проба без фотосенсибилизатора с облучением аппаратом «Аткус-2»; 3)vгистаминовая проба с нанесением 0,1 % геля фотодитазина без облучения; 4) гистаминовая проба с нанесением 0,1 % геля фотодитазина с последующим облучением аппаратом «Аткус-2». Для предотвращения засветки соседних экспериментальных участков их накрывали тканью. Оценку размера папул проводили через 20 минут после нанесения раствора гистамина.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием сред Windows 10 и компьютерной программы Excel 2016.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

При учете данных эксперимента начиная с 20-й минуты толщина кожной складки (папулы) при ее облучении незначительно отличалась от контроля – 4,8 ± 0,4 мм, в контроле – 5,4 ± 0,5 мм. Достоверные отличия между экспериментальной и контрольной группой наблюдались на 30-й минуте: толщина кожной складки после облучения лазером «Супер Сэб» с λ ≈ 1265 нм составила 3,9 ± 0,3 мм, в контроле – 5,3 ± 0,7 мм (p ≤ 0,01); на 40-й минуте после облучения – 3,4 ± 0,5 мм, в контроле – 4,6 ± 0,5 мм (p ≤ 0,01). Таким образом, установлено, что применяемые параметры облучения в этом диапазоне достоверно влияют на развитие воспалительного процесса, вызванного гистамином. Результаты эксперимента, проведенного на лабораторных животных, представлены в таблице 1.

ВТОРОЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования концентрации гистамина после его облучения in vitro показали отсутствие ее изменения при различных дозах лазерного облучения, они представлены в таблице 2 и на рисунке 1. Как видно из представленных данных, концентрация гистамина, определяемая по оптической плотности, практически не изменилась.

ТРЕТИЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении контрольных гистаминовых проб у добровольцев через 20 минут образовывались папулы размером 5,0 ± 0,6 мм с зоной гиперемии и выраженным зудом. Схожие результаты были получены при сочетании гистаминовых проб с облучением аппаратом «Аткус-2», размеры папул практически не отличались от контроля с гистамином без облучения. Сочетание постановки гистаминовых проб с нанесением фотосенсибилизатора «Фотодитазин» также приводило к появлению папул размером 5,3 ± 0,8 мм. Проведение облучения аппаратом «Аткус-2» после постановки гистаминовых проб с предварительным нанесением геля «Фотодитазин» на кожных участках через 20 минут приводило к появлению папул размером 3,0 ± 0,4 мм, достоверно отличающихся по размеру от данных предыдущих экспериментов (p ≤ 0,05) без гиперемии и зуда.

ОБСУЖДЕНИЕ

Следует сразу отметить, что полученные данные в этой серии экспериментов при их интерпретации ставят больше вопросов о причинах противовоспалительного эффекта с применением модели воспаления, вызванного гистамином, чем дают ответы на механизмы реализации воздействия, генерируемого синглетного кислорода в исследуемых объектах на развитие наблюдаемого процесса.

Парадоксально, но факт, что проведенная серия пилотных экспериментов показала подавление воспалительной реакции как при СКЭ, так и при ФДЭ в течении такого короткого промежутка времени.

При ФДЭ, наряду с другими, пока не выясненными, механизмами противовоспалительного действия можно предположить возможность прямой инактивации гистамина в тканях за счет изменения его химической формулы под воздействием синглетного кислорода. Также инактивация возможна в результате взаимодействия с гистамином продуктов фотолиза фотосенсибилизатора, образующихся при ФДЭ. При СКЭ этот момент маловероятен, так как количество синглетного кислорода, образующегося при нем для прямого воздействия на гистамин, невелико, а фотосенсибилизатор отсутствует. Можно предположить, что оба вида воздействия могут приводить как к увеличению микроциркуляции в местах воздействия, что обуславливает быструю элиминацию гистамина из ткани и, естественно, тем самым снижает его количество, что выражается в уменьшении воспалительной реакции (размер папул), так и к другим эффектам. Но, учитывая биологическую активность синглетного кислорода, вряд ли этот механизм является основным, во всяком случае при ФДЭ. Проведенные ранее исследования механизмов воздействия СКЭ и ФДЭ на структуру белковых молекул могут в той или иной степени объяснить полученные результаты также изменением структуры клеточных рецепторов к гистамину с утратой их чувствительности к нему. Возможны как все перечисленные механизмы, так и какие-либо другие, что нуждается в дальнейшем изучении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В пилотных экспериментах определены параметры облучения здоровых тканей, вызывающие противовоспалительный эффект при СКЭ и ФДЭ на модели воспаления, вызванного гистамином.

Заложена основа для продолжения исследований с целью выяснения некоторых аспектов взаимодействия синглетного кислорода с биологическими объектами.

Полученные данные дают основание для использования светокислородной и фотодинамической терапии для местного применения при заболеваниях, имеющих аллергический компонент, и проведение их не является противопоказанием при его наличии.

Результаты проведенных исследований являются лишь отправным моментом для проведения дальнейших исследований на более высоком методическом и техническом уровнях как in vitro, так и in vivo. По-видимому, одним из методов таких исследований для СКЭ и ФДЭ может быть иммуноферментный анализ, дающий достаточно объективную оценку биологически активных соединений при различных видах воздействий на их химическую структуру.