Фотодинамическая активность водной дисперсии наночастиц золота при лечении экспериментальных гнойных ран

ВВЕДЕНИЕ

Повышение эффективности терапии инфекционных поражений кожи и мягких тканей сохраняет свою актуальность. Это связано с нарастанием частоты встречаемости и распространением антибиотико-резистентных штаммов микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные процессы, что приводит к снижению эффективности традиционных методов терапии [1–3]. Еще одним из негативных последствий, связанных с использованием антимикробных препаратов, является развитие побочных реакций: их органотропное действие, возникновение аллергических реакций, дисбиоза и др. Согласно данным, представленным в ряде публикаций, в настоящее время перспективным направлением в лечении данной патологии является антимикробная фотодинамическая терапия (АФДТ) [4–6]. В ее основе лежит местное применение в очаге поражения фотосенсибилизатора (ФС), его селективное накопление в микробных клетках с последующей активацией светом с длиной волны, соответствующей пику поглощения фотосенсибилизатора. В процессе фотодинамической реакции образуется высокоактивный окислитель – синглетный кислород и другие активные формы кислорода (АФК), которые оказывают цитотоксическое действие. Его реализация связана с запуском каскада реакций перекисного окисления липидов и возникновения окислительного стресса, в результате чего происходит повреждение наружной цитоплазматической мембраны клеток и внутриклеточных органоидов, что ведет к гибели и фагоцитозу микробной клетки. В работе Е.В. Логуновой и А.Н. Наседкина [7] показано, что преимуществом АФДТ является локальное воздействие на патогенные микроорганизмы в ране и отсутствие системного воздействия на сапрофитную флору, высокая чувствительность микроорганизмов к действию АФДТ и отсутствие у них механизмов устойчивости, что позволяет применять данный метод для лечения заболеваний, вызванных полирезистентными штаммами микроорганизмов. Эффективность антимикробного фотодинамического воздействия зависит от особенностей строения клеточной стенки бактерий. Так, в обзоре [8] представлен анализ отечественной и зарубежной литературы, который позволяет судить о большей чувствительности грамположительных бактерий по сравнению с грамотрицательными, обладающими более сложной, многослойной наружной капсулой. В настоящее время имеется большое количество экспериментальных работ, посвященных антимикробной фотодинамической терапии гнойных и ожоговых ран, трофических язв сосудистой этиологии, пролежней и пр. [9–11]. Однако повышение эффективности АФДТ связано с поиском новых ФС, одновременно обладающих высокой фототоксичностью и низкой темновой токсичностью, при действии которых образуется достаточное количество АФК, способных преимущественно связываться с клетками микроорганизмов [12]. В клинической практике в качестве перспективных потенциальных ФС могут рассматриваться металлические наноструктуры, в частности наночастицы золота, которые применяются в терапии онкологических заболеваний [13–15].

Цель работы: изучение возможности использования водной дисперсии наночастиц золота в качестве фотосенсибилизатора для антимикробной фотодинамической терапии экспериментальных гнойных ран.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследованиях использовали водную дисперсию наночастиц золота, стабилизированных поливиниловым спиртом (AuPVA), предоставленную ООО «М9» (Тольятти) (рис. 1). Проведенные ранее исследования показали, что AuPVA характеризуется широким спектром антимикробной активности в отношении стандартных штаммов и клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжевых грибов, а ее рабочие концентрации не оказывают токсического воздействия в отношении биотест-объектов и культуры клеток дермальных фибробластов [16–18].

В исследованиях использовали белых беспородных крыс (самок), массой 200 ± 20 г, которые содержались на стандартном рационе вивария. Экспериментальные гнойные раны животным моделировали по методике [19]. Для этого на выбритом от шерсти участке межлопаточной области вырезали кожный лоскут с подкожной клетчаткой по контуру, предварительно нанесенному с помощью трафарета. В полученную рану диаметром 15 мм вводили марлевый тампон, содержащий взвесь суточной культуры S. aureus 209 Р в концентрации 10⁹ м.к./мл, после чего рану ушивали. Через 48 часов после операции края раны разводили, тампон удаляли, а рану обрабатывали 3%-ным раствором перекиси водорода для удаления гнойного содержимого. Все эксперименты были выполнены в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 «О защите животных от жестокого обращения» и предписаниями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990).

Все животные были разделены на 6 групп по 6 животных в каждой:

• группа 1 – контроль, раны без обработки;
• группа 2 – обработка раны гелем «Фотодитагель» («Вета-Гранд», Россия) с экспозицией 30 минут и последующим облучением лазером с длиной волны 670 нм;
• группа 3 – обработка раны водной дисперсией AuPVA;
• группа 4 – обработка раны водной дисперсией AuPVA с экспозицией 10 минут и последующим облучением лазером с длиной волны 405 нм;
• группа 5 – обработка раны водной дисперсией AuPVA с экспозицией 20 минут и последующим облучением лазером с длиной волны 405 нм;
• группа 6 – обработка раны водной дисперсией AuPVA с экспозицией 30 минут и последующим облучением лазером с длиной волны 405 нм.

Опытным группам животных препараты наносили на поверхность раны каждые двое суток. Группам животных 2 и 4, 5 и 6 после нанесения препаратов проводили сеансы АФДТ ран. В группе 2 в качестве источника излучения использовали полупроводниковый лазер с длиной волны излучения 670 нм («Геософт», Москва), в группах 4, 5 и 6 – полупроводниковый лазер с длиной волны 405 нм («Алком Медика», Санкт-Петербург). Дно раны облучали расфокусированным лучом (диаметр пятна облучения ≈ 10 мм, плотность мощности в группе 2 составила 1 Вт/см², в группах 4, 5 и 6 – 0,2 Вт/см²) сканирующими круговыми перемещениями световода в течение 1 мин.

Течение раневого процесса у экспериментальных животных оценивали по внешнему состоянию раны, а также по изменению площади ее поверхности. Для оценки эффективности санации рассчитывали ежесуточное уменьшение площади ран в % [20]:

,

где S – ежесуточное уменьшение площади ран, %/сут.; Sp – величина площади раны при предшествующем измерении; Sn – величина площади раны в настоящий момент; t – число дней между первым и последним измерением.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения Statistica 10.0 for Windows (StatSoft Inc., США), Microsoft Еxcel 2007 for Windows 7 (Microsoft Corp., США). Результаты считались статистически значимыми при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все животные, участвующие в эксперименте, были живы. На 3-и сутки от начала эксперимента значительных изменений в морфологии раневых дефектов не наблюдалось (рис. 2). Во всех группах животных в ранах наблюдалось присутствие фибринозно-геморрагического экссудата, дно покрыто фибрином, по краям выраженный отек. Статистически незначимое сокращение площади ран происходило в группах 4, 5 и 6.

К 5-м суткам в экспериментальных группах животных наблюдалось исчезновение перифокального отека, уменьшение количества экссудата и появление краевой эпителизации, что способствовало сокращению площади раневых дефектов, наиболее выраженному в группах 4, 5 и 6. В группе 1 у животных сохранялась отечность ран, в них присутствовал гнойный экссудат, а по краям отмечались некротические участки.

На 7-е сутки от начала эксперимента во всех группах животных происходило достоверное сокращение площади ран, а у животных, раны которых обрабатывали водной дисперсией AuPVA, раневые дефекты очищались от гнойного содержимого. Незначительное количество гнойного экссудата сохранялось в группе 2. Раны контрольной группы сохраняли гиперемию и отечность.

На 9-е сутки площади ран продолжали сокращаться во всех группах животных. Наиболее выраженно этот процесс наблюдался в группах 4, 5 и 6, причем статистически значимых отличий площади ран животных в этих группах установлено не было. Однако в группах сравнения 1, 2 и 3 заживление раневых дефектов протекало медленнее, и их площади составляли 124,8 ± 6,4, 48,4 ± 6,8 и 40,8 ± 8,2  мм² соответственно. Значительно изменилась морфология ран: во всех экспериментальных группах они полностью очистились от гнойного содержимого, происходила их активная эпителизация.

На 11-е сутки эксперимента наблюдалась сходная динамика сокращения площади раневых дефектов. Полное заживление ран в экспериментальных группах животных 4, 5 и 6 происходило на 13-е сутки, в группах 2 и 3 – на 15-е сутки, а в контрольной группе – на 21-е сутки.

Было установлено, что при проведении АФДТ с использованием в качестве ФС AuPVA скорость очищения экспериментальных ран от гнойного содержимого и их заживление не зависело от продолжительности предварительной экспозиции, что позволяет сократить время воздействия ФС на раневые дефекты до 10 минут.

Наличие поверхностно-активного вещества – поливинилового спирта в составе водной дисперсии AuPVA, с одной стороны, обеспечивает стабилизацию наноструктур, а с другой стороны, вероятно, приводит к повышению проницаемости клеточной стенки микроорганизмов и облегчает проникновение наночастиц [21–23]. Вероятно, очищение и последующее заживление экспериментальных гнойных ран при действии водной дисперсии AuPVA происходило благодаря ее выраженной антимикробной активности, в то время как использование фотодитагеля и облучения стимулировало механизмы неспецифической защиты организма животных, в частности, процессы фагоцитоза, а также активацию Т-клеточного звена [24][25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Водная дисперсия AuPVA может рассматриваться в качестве перспективного фотосенсибилизатора для проведения антимикробной фотодинамической терапии гнойных поражений кожи и мягких тканей, поскольку обработка экспериментальных гнойных ран приводила к достоверному уменьшению сроков их заживления в 1,6 раза по сравнению с контролем. Показана большая эффективность применения водной дисперсии AuPVA в сочетании с полупроводниковым лазером с длиной волны 405 нм по сравнению с ее самостоятельным использованием в качестве антисептического средства. Сходные результаты динамики раневого процесса были получены при использовании водной дисперсии AuPVA и Фотодитагеля в комплексе с облучением. Значительным преимуществом применения водной дисперсии AuPVA по сравнению со стандартным фотосенсибилизатором – Фотодитазином, входящим в состав Фотодитагеля, является уменьшение экспозиции воздействия на раневой дефект с 30 до 10 минут, что способствует оптимизации скорости и повышению эффективности антимикробной фотодинамической терапии.