Возможности оценки эффективности фотосенсибилизаторов на основе определения пороговых доз, вызывающих гемолиз эритроцитов

ВВЕДЕНИЕ

Изучение биологического действия фотосенсибилизаторов (ФС) с облучением терапевтическими лазерными источниками необходимо рассматривать в прикладном аспекте в доклинических исследованиях.

Эффективность ФС можно оценивать по различным критериям, таким как их физико-химический свойства (фотостабильность, интенсивность флуоресценции, эффективность генерации синглетного кислорода и т. д.) [1]. Эти критерии очень важны для последующего производства и определения перспектив применения ФС.

Однако они не позволяют определить степень воздействия на биологические мишени. Оценка эффективности ФС на биологических объектах in vitro (клетки водорослей, микроорганизмы, культуры клеток различных тканей, в том числе и опухолевых) дает возможность более полно оценить ожидаемые от них эффекты in vivo, подобрать необходимые концентрации препаратов и параметры облучения, провести их скрининг для дальнейшего клинического применения [2–9]. В наше время уже имеются ФС различных классов (синтетические ФС, такие как фталоцианины, производные гематопорфирина, хлорина Е6, бактериохлоринов и т. д.), которые успешно применяются в клинике. В связи с расширением практики применения фотодинамической терапии (ФДТ) продолжается поиск и разработка все новых и новых ФС с улучшенными качествами для лечения онкологических и неонкологических заболеваний [10–13].

Также продолжается поиск новых источников излучения в спектре действия этих ФС. Надо учитывать, что дальнейшее развитие медицины будет связано с развитием нанотехнологий, и это будет отражаться на способах воздействия на биологические мишени при патологических процессах и способах доставки лекарственных веществ к этим мишеням. Таким образом, фотодинамическое воздействие в перспективе будет осуществляться как на уровне целого организма, так на органном, тканевом, клеточном и, возможно, молекулярном уровнях. Для этого требуется использовать фотосенсибилизаторы и мощность излучения применяемых источников с оценкой безопасных и эффективных параметров.

Можно проводить оценку сравнительной эффективности ФС и при клиническом применении с помощью лазерной биофотометрии, капилляроскопии, флуоресцентной спектроскопии (в том числе оценивается и степень снижения флуоресценции в процессе ФДТ), а также фотоплетизмографии и лазерной допплеровской флуоресценции по измерению кровотока [14–17]. Но нет сомнений, что оценка эффективности имеет наибольший смысл в доклинических исследованиях, что позволяет определить наиболее подходящие и безопасные методики ФДТ. Это не отменяет учет критериев сравнения уже используемых ФС для каждой нозологической формы.

Работами отечественных исследователей показано, что эритроциты крови являются эффективным объектом оценки ФС по их гемолитической активности, так как последние имеют тропность к клеточным мембранам [18–21]. Мы предлагаем использовать гемолитическую модель действия фотосенсибилизаторов в качестве биологического эквивалента фотодинамического воздействия в упрощенном варианте. Таким образом, можно сравнительно оценивать необходимые дозы облучения и количество ФС по их воздействию на гемолиз эритроцитов, то есть эти параметры можно принять за биологическую единицу фотодинамического действия. При этом эквивалент этих параметров можно переносить на различные длины волн в зависимости от спектра их поглощения, так как речь идет в основном о фотосенсибилизаторах порфиринового ряда, у которых максимум поглощения приходится на полосу Соре.

Нами предложено определение концентрации ФС, являющейся пороговой для начала гемолиза эритроцитов, которая фиксируется измерением оптической плотности продуктов гемолиза эритроцитов (выход гемоглобина) [22].

Для этого нужен стандартный источник излучения со стандартной мощностью и плотностью облучения в диапазоне 390–410 нм (полоса Соре).

Цель нашего исследования: подтверждение эффективности пороговой дозы гемолиза эритроцитов при воздействии на различные ФС.

В качестве примера, подтверждающего эффективность данной методики, нами произведена оценка фотодинамического эффекта производного гематопорфирина – водорастворимая соль 2,4-ди-(альфа-метоксиэтил)-дейтеропорфирина-IX (Димегина) (рис. 1) и производного хлорина Е6 (Фотодитазина).

Димегин предназначен для лечения онкологических и неонкологических заболеваний, но пока не прошел клинических испытаний. В то же время препарат Фотодитазин разрешен для клинического применения (производство ООО «ВЕТА-ГРАНД»). Оба препарата имеют также спектры поглощения в применяемом в широкой клинической практике красном диапазоне: Димегин – 625–630 нм, Фотодитазин – 650–660 нм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании применялся аппарат фототерапевтический на базе лазерных диодов «АСТ» производства ООО «Панков-медикл», с выходной мощностью 0,5 Вт и длиной волны ≈ 405 нм. Эксперимент проводился на эритроцитах крови, взятой из подъязычной вены у крыс самцов массой 400–450 г. Брали 1 мл крови в мерную пробирку, содержащую 3 мл физиологического раствора. Далее осаждали эритроциты на центрифуге, удаляли тромб и отмывали. Отмытые эритроциты разводили физиологическим раствором до оптической плотности 0,6–0,7, измеряемой с помощью аппарата Multiscan MS (Labsystems, Финляндия). В пластиковую чашку диаметром 57 мм, высотой 14 мм к 1 мл взвеси разведенных эритроцитов добавляли 1 мл Димегина, растворенного в физиологическом растворе в одном эксперименте, а в другом эксперименте – 1 мл Фотодитазина в физиологическом растворе. Контролями в данной работе служили: 1) взвесь эритроцитов в физиологическом растворе без облучения, 2) взвесь эритроцитов в физиологическом растворе с облучением. Экспериментальные образцы: 3) взвесь эритроцитов в физиологическом растворе с добавлением раствора Димегина (или Фотодитазина) с облучением. Объем экспериментальной смеси составлял 2 мл с концентрацией ~ 7 × 10⁶ клеток в 1 мл. Облучение проводили с экспозиционной дозой 1,2 Дж/см², в течение 1 мин с расстояния 5 см. Площадь облученной поверхности равнялась 25,5 см². Регистрацию оптической плотности вели до облучения и после облучения через 1, 5, 10, 20, 30 и 40 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результатом проведенного исследования явилось то, что были определены концентрации Димегина и Фотодитазина (рис. 2, 3), не вызывающие гемолиза эритроцитов, которые соответствовали значению 0,975 мкг/мл. Концентрации Димегина и Фотодитазина, при которых наблюдалось проявление гемолиза суспензии эритроцитов, составляли 1,95 мкг/мл. На рисунках 4 и 5 видно, что на 10-й минуте после воздействия облучения совместно с фотосенсибилизаторами, происходит уменьшение оптической плотности по сравнению с контролями 1 и 2, которое свидетельствует о начале гемолиза суспензии эритроцитов.

Изначальным маточным раствором для исследования фотогемолиза Димегина и Фотодитазина являлся раствор 1 мг/мл (1000 мкг/мл), который разводили в два раза, получая следующие концентрации: 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,62, 7,81, 3,9, 1,95, 0,975 мкг/мл. В качестве стартовой концентрации использовали концентрацию 125 мкг/мл, которая приводила к фотогемолизу суспензии эритроцитов, не приводя к сильному изменению окраски самой суспензии. Концентрацией, вызывающей эффективный фотогемолиз, для Димегина и Фотодитазина являлась концентрация 31,25 мкг/мл, после которой шло постепенное уменьшение эффективности фотогемолиза суспензии эритроцитов, определяемое показателями оптической плотности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предлагаемый метод исследования эффективности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда является сравнительно простым и информативным. Оценивая эффективность исследуемых веществ с облучением в полосе Соре и зная их спектральные характеристики, можно оценить их эффективность и в других диапазонах длин волн по соотношению пиков поглощения. Метод подходит для стандартизации подобных препаратов. Полученные данные можно размещать в качестве справочной информации в каталогах для удобства при сравнении разных фотосенсибилизаторов. Возможно, вещества с известными молекулярными формулами будут модифицированы для усиления генерации синглетного кислорода с облучением определенными длинами волн. Таким образом, можно будет определять фотогемолиз при их оптимальных концентрациях.