Изучение воздействия лазерного излучения 1270 нм на репликацию вирулентных фаговых вирионов

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в нашей стране и за рубежом уделяется большое внимание изучению возможностей применения прямой фотогенерации синглетного кислорода (¹O₂) в медицинской практике [1][2]. Следует отметить, что возможность воздействия синглетного кислорода, образующегося посредством лазерного излучения в спектре его поглощения, на биологические объекты была высказана, а затем и подтверждена еще в конце 1980-х годов отечественными учеными [3][4]. В последствии этот эффект получил название «светокислородного» эффекта – СКЭ [5]. Наиболее изучены механизмы реализации ¹O₂ в биологических системах при фотодинамическом эффекте (ФДЭ), который давно применяется в клинической практике для лечения ряда заболеваний, хотя и здесь остается много невыясненных деталей [6][7][8]. ФДЭ является трехкомпонентным, т. к. для генерации синглетного кислорода используется фотосенсибилизатор + излучение в спектре его поглощения → с образованием ¹O₂. При СКЭ – это двухкомпонентный процесс: излучение в спектре поглощения кислорода (акцептор O₂) → образование ¹O₂ [9][10]. Таким образом, общим для них является образование одного и того же фотопродукта O₂, зависимость результатов воздействия на биологические объекты от поглощенной дозы (доза-эффект) [11][12][13]. Различия обусловлены квантовым выходом ¹O₂ (при ФДЭ он значительно выше), локализацией в биологических объектах (при ФДЭ он в основном реализуется в мембранных структурах клеток, при СКЭ он рассредоточен) и путем дезактивации. При ФДЭ дезактивация происходит в основном химическим путем, а при СКЭ значительно выше вероятность физического пути со сбросом возбуждения в окружающую водную матрицу с последующей ее структуризацией. Имеются косвенные доказательства, что СКЭ реализуется через образование синглетного кислорода в субклеточных структурах, возможно в цепи цитохромзависимых окислительно-восстановительных реакций. При определенной мощности действующего излучения не исключается и развитие некоторого термического эффекта на клеточном и субклеточном уровнях, влияющего на протекающие в них физико-химические процессы. Есть также предположения о способности ¹O₂ приводить к конформационным изменениям белковых структур [14]. При проведении фотодинамической терапии в клинической практике наблюдается ее противовирусный эффект [15][16]. Поэтому изучение воздействия СКЭ на вирусы представляет большой интерес из-за некоторой общности ФДЭ, связанной с генерацией синглетного кислорода. Сложность работы с вирусами, вызывающими различные острые и хронические инфекционные заболевания определило наш интерес к модели бактериофагов, являющиеся прототипами вирусов, лизирующих чувствительные к фагу бактериальные клетки. Известно, что в результате контакта происходит прикрепление фагов к поверхности поражаемой бактериальной клетки и после возникновения устойчивой связи между специфическим рецепторным участком и вирионом адсорбция фага становится необратимой. Далее фаговая ДНК поступает в цитоплазму бактериальной клетки, вызывает блокирование синтеза ее белков и после репликации и сборки зрелых вирионов наступает лизис клеточной стенки изнутри с выходом вирионов во внешнюю среду. Система фаголизиса базируется на наступающем в определенный специфический момент последовательном ферментативном гидролизе цитоплазматической мембраны. Гидрофобный мембранный белок-холин обеспечивает за счет разрушения цитоплазматической мембраны доступ второго фермента к клеточной стенке, который связан с аутолизином [17].

Цель: изучение влияние облучения лазерным излучением длиной волны 1270 нм на фаговые частицы вирулентного клебсиеллезного бактериофага.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали лечебный производственный клебсиеллезный бактериофаг. В качестве тест-культуры использовали штамм Klebsiella pneumoniae № 296, чувствительный к выбранному фагу. В качестве источника излучения использован экспериментальный прибор производства ООО «Новые хирургические технологии». Аппарат имеет непрерывный режим излучения лазерных полупроводниковых диодов с длиной волны 1270 нм (1268–1272 нм). Максимальная регулируемая мощность излучения – до 3 Вт. Аппарат является моноблоком. В состав блока входят: полупроводниковый излучатель, совмещенный с оптическими элементами и световодами вывода излучения, источник питания, блок управления лазером. В проводимом эксперименте мощность излучения составляла 150 мВт. Вначале определяли количество активных фаговых частиц (титр бактериофага). Для этого пипеткой отбирали 1,0 мл исходной концентрации бактериофага и вносили в пробирку с 9,0 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия (рН 7,0) или фосфатного буфера (рН 7,0), чтобы получить исходное разведение в 10 раз, т. е. первое десятикратное разведение. Далее готовили ряд пробирок с 4,5 мл мясопептонного бульона (МПБ) и приготавливали дальнейшие десятикратные разведения. Для этого в расставленные в штативе бактериологические пробирки (№ 2–9) вносили по 4,5 мл стерильного МПБ. Из 1-го разведения стерильной пипеткой объемом 1 мл с неповрежденным концом переносили 0,5 мл первого десятикратного разведения бактериофага в пробирку № 2, содержащую, как и весь ряд, 4,5 мл МПБ. При этом кончик пипетки прислоняли к внутренней стенке пробирки, не касаясь содержащейся в ней жидкости. После этого пипетку сбрасывали, брали другую такую же пипетку и перемешивали разведение в пробирке № 2 путем пипетирования не менее 5 раз. После перемешивания этой же пипеткой переносили 0,5 мл в следующую пробирку, соблюдая те же правила. Из приготовленных разведений отбирали 0,5 мл бактериофага и вносили в 4,5 мл расплавленного и остуженного до 45 °С полужидкого 0,5%-ного агара, перемешивали, затем вносили 0,1 мл 10 млрд взвеси суточной бульонной культуры клебсиелл и выливали вторым слоем на заранее подготовленные чашки с 1,5%-ным мясопептонным агаром (первый слой). Инкубировали в термостате в течение суток, учитывали на каждой чашке количество негативных (фаговых) колоний и рассчитывали исходный титр используемого бактериофага.

Опыты с облучением. Первоначально в ряд полистероловых виал вносили по 0,5 мл фага, содержащего 10⁸ фаговых частиц в 1 мл. Предварительно верхнюю часть виалы с крышечкой срезали и вставляли в апертуру лазерного аппарата. Окончательные размеры срезанной виалы: диаметр – 5 мм, длина – 44 мм, вместимость – 0,5 мл. Мощность излучения – 0,15 Вт, время экспозиции – 5, 10, 15 и 30 мин (дозы – 225, 450, 675 и 1350 Дж/см² соответственно). Объем пробы – 0,5 мл в физиологическом растворе NaCl. Расстояние облучения стандартное, так как фиксировано срезом виалы, и равно 44 мм. Затем каждые 3 виалы для получения статистически достоверных значений поочередно облучали лазером с длиной волны 1270 нм. Первые три виалы облучали 5 мин, вторые три – 10 мин, третьи – 15 мин. Следует отметить, что температура суспензии в процессе облучения не превышала 40–42 °С, т. е. не отражалась на количестве жизнеспособных фаговых частиц. Три отдельные виалы с фагом служили контролем без облучения. Затем из каждой виалы отсасывали автоматической пипеткой со съемными наконечниками 0,25 мл содержимого и готовили ряд десятикратных разведений фага (10¹–10⁹). Разведения готовили в бактериологических пробирках с МПБ в соотношении 1:10 (0,25 мл облученной взвести бактериофага + 2,25 мл бульона). Затем 1,0 мл каждого разведения фага смешивали с 4,5 мл полужидкого 0,7%-ного МПА, остуженного до температуры 45 °С, и 0,1 мл бульонной суточной тест-культуры K. pneumoniaе 296. Содержимое пробирок перемешивали и выливали вторым слоем на чашки с 1,5%-ным МПА. Чашки инкубировали при 37 °С в течение ночи и учитывали количество негативных колоний.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Количество жизнеспособных фаговых частиц в исходном растворе клебсиеллезного бактериофага составило 5×10⁸. Облучение фага лазерным излучением длиной волны 1270 нм привело к снижению количества жизнеспособных фаговых частиц до 10⁵. Результаты представлены в таблице.

Результаты практически не зависели от времени облучения, т. е. титры фага были в равной мере снижены при воздействии лазерного излучения как в течение 5, 10 и 15 мин. Аналогичный эффект, по-видимому, можно наблюдать и в отношении патогенных для человека вирусов.

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Облучение клебсиеллезного бактериофага лазерным излучением длиной волны 1270 нм приводит к снижению количества жизнеспособных фаговых частиц на 3 порядка логарифма (исходный титр – 10⁸, после обработки – 10⁵ негативных фаговых колоний), что говорит об их повреждении. Механизмы повреждения фаговых частиц нуждаются в дальнейшем изучении с целью выяснения возможности применения излучения с этими длинами волн в медицинской практике, однако, основываясь на имеющихся данных, можно предполагать и возможность конформационного изменения белковых структур вирионов бактериофага.