В работе использовали лазерное излучение «синего» спектрального диапазона (λ = 450 нм), с мощностью до 10 Вт и диаметром пятна 0,6–1,5 мм, генерируемое в непрерывном и импульсном режиме диодным лазерным аппаратом «Лазермед 10–03», разработанным для медицинских целей в ООО «Русский инженерный клуб», г. Тула, Россия (рис. 3).

Экспериментальное исследование включало два раздела: in vitro и in vivo.

В эксперименте in vitro задействовано две мини-свиньи: 24 образца охлажденных препаратов печени и мышечной ткани, выполнено исследование 24 макроскопических препаратов и 24 соответствующих гистологических препаратов.

В эксперименте in vivo в качестве биологической модели было задействовано 36 живых пигментированных черными пятнами лабораторных крыс в возрасте

6–8 месяцев, выполнено 168 экспериментальных проб пигментированной кожи, исследование 168 макроскопических и 168 соответствующих гистологических препаратов.

Образцы биотканей с зонами воздействия лазерного излучения (λ = 450 нм) для гистологического исследования фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Дальнейшее исследование проводили в автоматическом режиме для гистологической проводки в аппарате фирмы Excelsior (Termo Scientific, Великобритания), заливали в парафин на аппарате ЕС350 (Microm, Германия). С парафиновых блоков получали срезы толщиной 2–3 мкм на микротоме НМ355S с системой переноса срезов STS (Termo Scientific, Великобритания). Гистопрепараты депарафинировали и выполняли окраску гематоксилином и эозином. Гистологические препараты просматривали в микроскопе СХ41 (Olympus, Япония). Микрофотографии гистологических препаратов получали сканированием на микроскопе Pannoramic Midi (3DHISTECH, Венгрия) и изучали при различном увеличении полученное полноценное изображение с анализом и интерпретацией результатов. Гистологическое исследование зон лазерного воздействия проводили с оценкой морфометрических параметров и замером участков поврежденных тканей.

На охлажденные образцы печени через ее капсулу и на мышцы воздействовали в импульсном и непрерывном режиме единичными импульсами с неподвижным лазерным пятном излучения (λ = 450 нм).

В непрерывном режиме использовали режимы мощности излучения (λ = 450 нм): 1,0, 3,0, 6,0 и 10,0 Вт, время воздействия было постоянным – 1 секунда, диаметр лазерного пятна на поверхности объекта – 1,0 мм.

В импульсном режиме на образцы воздействовали лазерным излучением в импульсном режиме, с неподвижным лазерным пятном диаметром 1,0 мм на поверхности объекта. Использовали переменные параметры лазерного излучения (λ = 450 нм): мощности (1,0, 3,0, 6,0 и 10,0 Вт), а также длительность импульса 0,5 сек. и расстояние между импульсами 0,5 сек.

При выполнении эксперимента изучали визуально определяемые макроскопические изменения в зонах воздействия на поверхности указанных образцов. В дальнейшем было выполнено гистологическое исследование соответствующих препаратов.

В эксперименте in vivo в качестве биологической модели было задействовано 36 пигментированных черными пятнами лабораторных крыс в возрасте 6–8 месяцев.

Предварительно живую лабораторную крысу взвешивали, затем вводили анестезиологический препарат по инструкции. Эксперименты проведены под общим обезболиванием, анестезиологическим пособием: препаратом «Золетил» из расчета 0,1 мл на 100 мг веса лабораторного животного путем внутримышечного введения. В области спины проводили эпиляцию кожного покрова с помощью электробритвы (фирмы Moser) насадкой под 0, затем кожу спины обрабатывали неспиртовыми антисептическими растворами (хлоргексидин или мирамистин).

На кожу воздействовали лазерным излучением (λ = 450 нм) с постоянными параметрами диаметра лазерного пятна 1,0 мм и с постоянной скоростью однократного сканирования 0,5 см в 1 секунду по поверхности зоны объекта.

В непрерывном режиме лазерного излучения использовали переменные параметры мощности: 3,0, 6,0 и 10,0 Вт. Параметры режимов непрерывного лазерного излучения (λ = 450 нм), использованные в эксперименте in vivo представлены в таблице 1. Соответствующие им зоны воздействия на коже спины лабораторных крыс обозначены стрелочками с нумерацией режимов и представлены на рисунке 4.

В импульсном режиме лазерного излучения (λ = 450 нм) с постоянной длительностью импульса 0,5 сек. использовали переменные параметры: интервал между импульсами 0,5, 0,25 и 0,1 сек. и мощность 3,0, 6,0 и 10,0 Вт. Параметры режимов импульсного лазерного излучения (λ = 450 нм), использованные в эксперименте, представлены в таблице 2. Соответствующие им зоны воздействия на коже спины лабораторных крыс обозначены стрелочками с нумерацией режимов и представлены на рисунке 5.

Забор экспериментального материала для гистологического исследования осуществляли сразу после воздействия, на 4, 7, 12, 21, 30 и 90-е сутки методом хирургического иссечения под общим обезболиванием препаратом «Золетил». Лабораторное животное выводили из эксперимента путем гуманной эвтаназии с увеличением дозы данного препарата (согласно руководству и материалам Федерации европейских научных ассоциаций по лабораторным животным: FELASA).

При выполнении эксперимента изучали визуально определяемые макроскопические изменения в зонах воздействия на поверхности указанных образцов, фиксировали фотодокументированием. Далее из макропрепаратов кожи готовили соответствующие гистопрепараты для последующего исследования. В течение всего периода наблюдения за биологическими моделями на основании результатов макроскопического и гистологического исследования изучали состояние тканей и особенность течения регенеративного раневого процесса в зонах воздействия.

Было определено, что при всех использованных параметрах лазерного излучения наличие округлых дефектов-кратеров с коагуляционным коричнево-желтого цвета венчиком вокруг. Размеры их увеличиваются от 0,5 до 2,0 мм при большей энергетике непрерывного режима, причем при импульсном режиме и мощности 1,0 Вт видимый эффект отсутствует.

Отмечено, что при использовании импульсного режима на печени образуются дефекты значительно меньшего размера от 0,3 до 1,5 мм, чем при применении непрерывного режима при сравнимых параметрах излучения. Примеры представлены на рисунках 6 (А, Б, В, Г) и 7 (А, Б, В, Г).

Результаты гистоморфологического исследования ткани печени, на основании которых были определены особенности воздействия лазерного излучения (λ = 450 нм) в непрерывном и импульсном режиме.

Лазерное излучение (λ = 450 нм) в непрерывном режиме при обозначенных параметрах мощности оказывает выраженное термическое повреждение на ткань печени. В зонах воздействия присутствуют все участки деструктивных и распространенных повреждений, характерные для лазерного излучения, шириной на поверхности до 1150,0 ± 250,0 мкм, глубиной до 230,0 ± 100,0 мкм. Проявления их сходные при использованных параметрах мощности и усиливаются до образования значительного размера минусового дефекта-кратера при непрерывном воздействии с мощностью 10,0 Вт (рис. 8).

В импульсном режиме лазерное излучение (λ = 450 нм) формирует термическое повреждение в виде широких до 1350,0 ± 150,0 мкм деструктивных изменений, представленных на поверхности тонким слоем 45,0 ± 5,0 мкм компактного коагуляционного некроза, под которым присутствует слой гомогенизированной ткани до 200,0 мкм ± 50 мкм (рис. 9).

Таким образом, импульсный режим по сравнению с непрерывным режимом при всех сравнимых параметрах имеет схожее воздействие, которое носит прогнозируемый стабильный характер повреждения, глубиной 250,0 мкм ± 50 мкм, но более выраженный по интенсивности компактного коагуляционного эффекта на поверхности.

При всех использованных параметрах непрерывного режима было отмечено образование округлой формы слегка заглубленной бело-желтого цвета поверхности, размеры которой увеличиваются от 0,5 до 2,5 мм с нарастанием мощности. В центре зоны воздействия при 6,0 Вт присутствовал более темного цвета, точечный, минусовой дефект до 0,2 мм, более выраженный при 10,0 Вт (рис. 10).

В импульсном режиме при мощности 3,0 Вт определен незначительный эффект воздействия в виде слегка беловатой поверхности диаметром не более 0,5 мм. При использовании мощности 6,0 Вт и 10,0 Вт отмечено наличие поверхностных округлых беловато-желтого цвета дефектов диаметром 1,0 и 2,0 мм соответственно, минус-ткань в центре не определяется (рис. 11).

Сравнительный анализ макропрепаратов мышц определил, что при использовании указанных параметров импульсного режима по сравнению с непрерывным режимом излучения на мышцах образуются значительно меньшего размера дефекты, чем при применении последнего.

При использовании непрерывного режима (λ = 450 нм) отмечен выраженный термический эффект, который носит поверхностный характер в виде тонкого слоя компактного коагуляционного некроза, средней глубиной до 250,0 ± 120,0 мкм, без повреждения подлежащих миоцитов (рис. 12).

В импульсном режиме использование лазерного излучения (λ = 450 нм) термическое повреждение выявлено только при увеличении мощности до 6,0 Вт в виде тонкого слоя компактного коагуляционного некроза на поверхности средней глубиной 190,0 мкм ± 20,0 мкм (рис. 13).

Таким образом, импульсный и непрерывный режим при всех указанных параметрах имеет схожее термическое воздействие на мышечную ткань, которое носит стабильно неглубокий характер повреждения, при использовании импульсного режима оно более поверхностное по сравнению с непрерывным режимом.

Результаты сравнительного анализа использования лазерного излучения с длиной волны 450 нм в импульсном режиме с мощностью 3,0 Вт и интервалом между импульсами 0,1, 0,25 и 0,5 сек. определили, что образующиеся участки коагуляционного некроза при времени между импульсами 0,5 сек. более выраженные и большей глубины до 336 ± 15,0 мкм по сравнению с другими указанными периодами тепловой релаксации. В свою очередь, при использовании времени между импульсами 0,25 сек. по сравнению с 0,1 сек. отмечено наличие более гармоничных и менее выраженных коагуляционных изменений, глубиной до 150,0 ± 10,0 мкм (рис. 14).

Таким образом, на основании результатов сравнительного анализа использования выше указанных параметров лазерного излучения λ = 450 нм в импульсном режиме при мощности 3,0 Вт было определено, что оптимальным для дальнейшего экспериментального исследования являются длительность импульса 0,5 сек и время между импульсами 0,25 сек.

Сразу после воздействия излучения определяется светлый ровный участок поверхности, выполненной беловато-желтой коагуляционной корочкой. При использовании большей энергетической активности и непрерывном режиме излучения данная послеоперационная корочка более плотная и интенсивнее окрашена в желто-коричневый цвет, с 12-х суток отмечено ее частичное отторжение с краев, причем при использовании непрерывного режима она сохраняется дольше – до 21-х суток, полное отторжение которой при всех режимах определяется на 30-е сутки. Эпителизация раневой поверхности отчетливо определяется с 21-х суток, все зоны воздействия представлены светлой кожей без пигментации, которая присутствует и на 90-е сутки. Воспалительные проявления на всех сроках наблюдения отсутствуют.

Примеры макроскопических изменений на разных сроках в зонах воздействия лазерного излучения λ = 450 нм при использовании непрерывных и импульсных режимов представлены на рисунках 15–19.

Во всех случаях сразу после воздействия поверхность светло-желтого цвета, ровная, выполнена тонкой сухой коагуляционной корочкой, пигментация не определяется.

На 12-е сутки при всех непрерывных режимах поверхность зоны воздействия выполнена сухой желто-серого цвета коагуляционной корочкой, частично отторгшейся с краев, в окружающих тканях – незначительные воспалительные проявления.

При импульсном режиме с мощностью 3,0 Вт в центре сохраняется небольшая коагуляционная корочка, на месте ее отторжения – светлая кожа; при 6,0 и 10,0 Вт поверхность выполнена сухой коагуляционной корочкой желто-коричневого цвета, частично отторгающейся у краев.

На 21-е сутки при всех непрерывных и импульсных режимах, кроме мощности 10,0 Вт непрерывного режима, в зоне воздействия отмечено полное отторжение послеоперационной корочки, наличие светлой кожи без пигментации, эпителиальная выстилка сохранена, признаков воспаления нет. При 10,0 Вт непрерывного режима присутствует сухая желтого цвета коагуляционная корочка, отторгающаяся с краев.

При всех использованных непрерывных и импульсных режимах в зоне воздействия на 30-е сутки отмечена светлая кожа без пигментации, деформации кожного покрова нет, в окружающих тканях воспалительные проявления не определяются.

На 90-е сутки в зонах воздействия во всех случаях отмечается светлая эпителизированная кожа без пигментации, деформация поверхности не определяется.

Сразу после воздействия в непрерывном режиме определяется на поверхности тонкий участок компактного коагуляционного некроза средней толщиной 10,0 мкм ± 5,0 мкм, далее участок коагуляционного гомогенного некроза средней толщиной 550,0 ± 250,0 мкм с переходом в неизмененную ткань. Придатки кожи с коагуляционными изменениями сохраняются в основном в более глубоких подлежащих участках кожи, единичные до поверхности. Более выраженные коагуляционные изменения отмечены при увеличении мощности до 10,0 Вт до подкожно-жировой клетчатки, где сохраняются придатки кожи с коагуляционными изменениями, карбонизация не определяется (рис. 20).

При воздействии в импульсном режиме поверхность представлена коагуляционным некрозом толщиной 275,0 ± 125,0 мкм, придатки кожи сохраняются частично в зоне некроза, прослеживаются до поверхности, карбонизации нет. С увеличением мощности толщина и плотность коагуляционных изменений увеличиваются незначительно (рис. 21).

На 12-е сутки при непрерывном режиме с мощностью 3,0 Вт зона воздействия выполнена восстановившимся эпидермисом и базальным слоем эпителия с множественными кератиноцитами, толщиной 365,0 мкм. Структура кожи сохранена, включая единичные придатки. При мощности 6,0 и 10,0 Вт зона воздействия выполнена коагуляционным некрозом, средней толщиной 625,0 ± 25,0 мкм. Эпителий деструктурирован, гомогенизирован (рис. 22).

При импульсном режиме с мощностью 3,0 Вт зона воздействия на 12-е сутки выполнена восстановившимся эпидермисом и базальным слоем эпителия толщиной 120,0 мкм. Структура кожи сохранена, включая множественные ее придатки. При мощности 6,0 и 10,0 Вт зона воздействия представлена коагуляционным некрозом средней толщиной 450,0 ± 75,0 мкм. Под зоной некроза определяется подкожно-жировая клетчатка с коагуляционными изменениями, придатки кожи единичные с коагуляционными изменениями (рис. 23).

На 21-е сутки при непрерывном режиме зона воздействия выполнена восстановившимся эпидермисом и эпителием с множественными кератиноцитами средней толщиной 500,0 ± 200,0 мкм. С увеличением мощности до 6,0 и 10,0 Вт определяется слой гиперкератоза и акантоза. Под эпителием относительно широкий слой хаотично расположенных и организующихся параллельно поверхности коллагеновых волокон (рис. 24).

При импульсном режиме зона воздействия на 21-е сутки выполнена восстановившимся эпидермисом и эпителием с множественными кератиноцитами толщиной 350,0 ± 100,0 мкм. Отмечено полное восстановление всех слоев эпителия и его придатков, базальная клеточная зона роста отчетливая ровная. Под эпителием определяется зона частично правильно организованных параллельно поверхности коллагеновых волокон (рис. 25).

К 21-м суткам при всех режимах отмечается полное восстановление эпителиального слоя и организация под ним зоны коллагеноза из организующейся параллельной поверхности коллагеновых волокон, причем толщина этого слоя практически не зависит от использованного режима мощности.

На 30-е сутки при использовании непрерывного режима структура кожи восстановлена полностью, включая придатки. Отмечается гиперкератоз на поверхности, выраженный акантоз. Под эпителием относительно широкий слой организованных параллельно поверхности коллагеновых волокон толщиной 600,0 ± 50,0 мкм (рис. 26).

В импульсном режиме при всех параметрах мощности отмечено полное восстановление всех слоев эпителия и его придатков, базальная клеточная зона роста отчетливая ровная, отмечается незначительный гиперкератоз на поверхности. Под эпителием присутствует зона коллагеновых волокон, расположенных параллельно поверхности, толщина слоя коллагеноза при всех режимах мощности почти одинаковая и равна 450,0 мкм ± 50,0 мкм (рис. 27).

Таким образом, к 30-м суткам при всех режимах отмечено полное восстановление эпителиального слоя и организация под ним зоны коллагеноза из параллельной поверхности коллагеновых волокон, причем толщина слоя повреждения практически не зависит от использованного режима мощности. В случае применения непрерывного режима проявления восстановительных регенеративных изменений (акантоз, гиперкератоз и других) более выраженные в ответ на более агрессивное воздействие.

На 90-е сутки при использовании непрерывного режима зона воздействия выполнена восстановившимся эпидермисом и под ним равномерно параллельно расположенными коллагеновыми волокнами толщиной слоя до 500,0 мкм ± 150,0 мкм (рис. 28).

При применении импульсного режима зона воздействия выполнена восстановившимся эпидермисом и хорошо организованным участком с равномерно параллельно расположенными коллагеновыми волокнами толщиной слоя до 800,0 ± 50,0 мкм (рис. 29).

Таким образом, на 90-е сутки при всех использованных режимах лазерного излучения (λ = 450 нм) отмечено полное восстановление эпителия, последний слегка утолщен, его придатки хорошо определяются, под ним широкий слой правильно ориентированных параллельно поверхности кожи коллагеновых волокон средней толщиной 700 ± 150,0 мкм.

В результате экспериментального исследования in vitro отмечено: лазерное излучение с длиной волны 450 нм оказывает прогнозируемое относительно неглубокое термическое повреждение биологических тканей, от 200 до 450 мкм, увеличивающееся в соответствии с увеличением мощности.

Лазерное излучение (λ = 450 нм) вызывает термическое повреждение ткани печени с образованием всех участков термического повреждения, свойственных лазерному воздействию, проявления которых сходны при использованных параметрах, менее выраженные при импульсном режиме, и усиливаются до образования минусового дефекта-кратера при непрерывном воздействии с мощностью 10,0 Вт.

Воздействие при использовании сравнимых параметров лазерного излучения с длиной волны 450 нм на ткань печени боле выраженное по сравнению с мышечной тканью.

На основании анализа серии исследования in vivo по воздействию лазерного излучения с длиной волны 450 нм в непрерывном и импульсном режиме отмечены:

Воздействие на пигментированные ткани осуществляли «синим» лазерным излучением с длиной волны (λ = 450 нм), имеющим высокий коэффициент селективного поглощения меланином и гемоглобином, в меньшей степени водой. Этот феномен обеспечивает послойное и прогнозируемое удаление тканей пигментных образований с сохранением проксимальных участков придатков кожи. Данный факт обеспечивает «центральную» эпителизацию, заживление раневой поверхности в физиологические сроки, площадь которой в этом случае не ограничена установленными критериями и может быть относительно большой, а также минимальное повреждение подлежащих тканей. В экспериментальном исследовании определены оптимальные параметры лазерного излучения с длиной волны 450 нм, применение которых может быть перспективно при дальнейшем использовании в клиническом исследовании для послойного удаления пигментных тканевых структур кожи путем сканирования.

Экспериментально определены особенности «синего» лазерного излучения с длиной волны 450 нм для послойного и прогнозируемого удаления тканей пигментных образований кожного покрова с сохранением проксимальных участков придатков кожи, обеспечивающие удаление рассматриваемых образований на относительно большой площади при минимальном повреждении подлежащих тканей.

Для лечения различных пигментных структур кожи, включая ВГПН, экспериментально определены оптимальные режимы лазерного излучения с длиной волны 450 нм – мощностью 3,0 и 6,0 Вт с длительностью импульса 0,5 сек. и временем между импульсами 0,25 сек.

Лазерное излучение «синего» спектрального диапазона с длиной волны 450 нм перспективно для послойного удаления сканированием тканей пигментных образований кожи, включая ВГПН.